MINAMBIENTE - Resolución 1054 de 2025

Ambiente RESOLUCIÓN NÚMERO pe 28 JUL 2025 “Por medio de la cual se acepta una solicitud de Contrato de Acceso a losRecursos Genéticos y sus Productos Derivados, presentada por la UniversidadNacional de Colombia en el marco de lo establecido en el artículo 6 de la ley1955 de 2019” EL DIRECTOR DE BOSQUES, BIODIVERSIDAD Y SERVICIOSECOSISTEMICOS En ejercicio de sus facultades legales y especialmente las conferidas en elnumeral 14, del artículo 16 del Decreto Ley 3570 de 2011 y la Resolución No.0967 del 10 de julio de 2025, CONSIDERANDO ANTECEDENTES La Universidad Nacional de Colombia mediante el radicado N 1-2021-17168 del20 de mayo de 2021, presentó solicitud de Contrato de Acceso a los RecursosGenéticos y sus Productos Derivados con el fin de autorizar las actividades deacceso a recursos genéticos llevadas a cabo en desarrollo del proyecto deinvestigación denominado “Estudio de la actividad biológica de proteínas Cry sobreinsectos plaga que afectan cultivos de importancia económica” solicitud presentadaen el marco de lo establecido en el artículo 6° de la Ley 1955 de 2019. Que, mediante Auto N 213 del 05 de julio de 2022 el Ministerio de Ambiente yDesarrollo Sostenible admitió la solicitud presentada por la Universidad Nacionalde Colombia, para regularizar las actividades de acceso a los recursos genéticos ysus productos derivados.en el proyecto de investigación mencionado. A su vez,mediante el mismo Auto se ordenó a la Universidad Nacional de Colombia, realizarla publicación de un extracto de su solicitud.

Que la Universidad Nacional de Colombia, dio cumplimiento a lo ordenado, ymediante radicado 2022E1023447 del 8 de julio de 2022 allegó publicaciónsolicitada, dando cumplimiento a lo ordenado por esta Autoridad Ambiental. Que en cumplimiento de lo previsto en el artículo 29 de la Decisión Andina 391 de1996 y las competencias asignadas por el Decreto 3570 de 2011, la Dirección deBosques, Biodiversidad y Servicios Ecosistémicos, emitió el Dictamen Técnico LegalNo. 373 del 10 de junio de 2025, mediante el cual se concluyó que la solicitud decontrato de acceso a recursos genéticos y productos derivados presentada por laUniversidad Nacional de Colombia, para autorizar las actividades en desarrollo delproyecto de investigación denominado: “Estudio de la actividad biológica deproteínas Cry sobre insectos plaga que afectan cultivos de importancia económica.”es viable técnica y jurídicamente en los términos establecidos en la Decisión Andina391 de 1996, y así mismo, se tuvo en cuenta la siguiente información:

1. “ANÁLISIS DE LOS ASPECTOS TÉCNICOS DE LA SOLICITUD DEACCESO 1.1 Justificación Bacillus thuringiensis (Bt) ha venido utilizándose durante más de un siglocomo una opción importante en el manejo de insectos plaga, y másrecientemente en la producción de plantas resistentes al ataque de estos ' : Página 1 de 21F-M-TNA-4A:'VaA 21-02-2074— 1054

“Por medio de la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticos y sus productosderivados, presentada por la Universidad Nacional de Colombia en el marco de lo establecido en el artículo6 de la ley 1955 de 2019” Ambiente sa (transgénicas) (Roh et al.,2007). Dicha bacteria tiene la capacidadmetabólica de producir durante su fase estacionario delta-endotoxinas conuna reconocida actividad biocontroladora, las cuales se han denominado Cryy Cyt. Las toxinas Cry han sido las más utilizadas en el control de insectos-plaga (Crickmore et al.,1998). Colombia, considerado como un país megadiverso, presenta suelos ricos enmicroorganismos, entre estos, diferentes cepas nativas de Bacillusthuringiensis han sido aisladas e identificadas y recobran una ampliaimportancia para el control de plagas nativas y no nativas que ataquencultivos en el país, considerándose así a estos bioinsecticidas como unaalternativa al uso de productos químicos contaminantes. Una de las principales desventajas reconocida con los años por el uso de estebioinsecticida es la resistencia que pueden llegar a tener o adquirir losinsectos blancos. Es por esto por lo que las investigaciones dirigidas adeterminar su modo de acción en el intestino de los insectos han tomado altaimportancia. Dentro del modo de acción planteado, se ha encontrado que unfactor clave son los receptores de membrana presentes en el intestino mediode insectos, los cuales tienen la capacidad, al interactuar con toxinas Cry, deinducir la formación de un poro lítico en el intestino que promueve la muertede las plagas.

En este orden de ideas es evidente la importancia de determinar toxinas Crypresentes en cepas nativas de Bacillus thuringiensis que sean activas contradiferentes insectos plaga que ataquen cultivos de importancia económica enColombia, como los son los cultivos de papa, maíz entre otros. Así mismo,para contrarrestar o evitar una posible resistencia y para potenciar laactividad biocontroladora, también es relevante identificar a nivel genéticoproteínas receptoras de dichas toxinas presentes en el intestino medio delepidópteros y coleópteros, como base para el establecimiento de unaestrategia de control biológico. 1.2 Alcance del proyecto Se realizaron actividades de prospección biológica. 1.3 Objetivo general Estudiar la actividad biológica de proteínas Cry recombinantes y producidaspor cepas nativas de Bacillus thuringiensis sobre insectos plaga que afectancultivos de importancia económica. 1.4 Objetivos específicos + Detectar por PCR genes que codifican proteínas Cry en cepas nativas deBacillus thuringiensise Establecer la actividad tóxica de las proteínas Cry sobre larvas de primerinstar de plagas de importancia económica.¢ Identificar la presencia de receptores de toxinas Cry en el intestino mediode insectos plaga.+ Evaluar proteínas recombinantes Cry contra insectos plaga que afectancultivos de importancia económica. 1.5 Área de aplicación Biotecnología agrícola Página 2 de 21F-M-INA-46:V4 21-08-20241 ——- 1054

“Por medio de la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticos y sus productosderivados, presentada por la Universidad Nacional de Colombia en el marco de lo establecido en el artículo6 de la ley 1955 de 2019” Ambiente 2 Lista de referencia de los recursos biológicos a partir de los cuales seobtuvo los recursos genéticos - Artículo 6% de la Ley 1955 de 2019. La Universidad Nacional de Colombia en la solicitud remitida en el marco delArtículo 6° de la Ley 1955 de 2019, solicita amparar las actividades de accesoa partir de la recolección realizada desde 2008; la Universidad informa que serealizaron actividades de recolección de coleópteros sobre los cuales se aislaronbacterias, las cuales fueron objeto del acceso (tabla 1). Tabla 1. Lista de especímenes biológicos trabajados en la ejecución delproyecto. Cantidad de aEspecie especimenes snarecolectadosAsymmathetes 22vulcañórim 1.638 Recolección Premnotrypes vorax | No se reporta | RecolecciónBacillus ssp. 1365 Acceso Es importante aclarar que con relación a los especímenes recolectados de P.vorax, la universidad manifiesta que no se tiene el número exacto debido a queen su momento “Se estableció un pie de cría para la realización de losbioensayos. Adicionalmente, De acuerdo, No obstante, de acuerdo con López etal. (2009), A partir de un número no definido de muestras de individuos muertosde P. vorax obtenidos del suelo y de los tubérculos de papa, se obtuvieron 12cepas de B. thuringiensis”.

2.1 responsable técnico

Nombre o Razón Social: Jairo Cerón SalamancaNacionalidad: colombianaDocumento de Identidad: C.C No. 9.521.206Domicilio Legal: Calle 135 No. 7-42 apto 901-T 3Teléfono: 3112479672Correo electrónico: jacerons@unal.edu.co 2.2 Proveedor del recurso

Nombre o Razón Social: Ministerio De Ambiente y Desarrollo Sostenible.Documento de Identidad: NIT. 830115395-1.Domicilio Legal: CALLE 37 #8 - 40.Teléfono: 6013323400.Correo electrónico: servicioalciudadanoQminambiente.gov.co. 2.3 Duración del proyectoProyecto finalizado. Las actividades iniciaron en 2008 y finalizaron el 27 demayo del 2019. 2.4 Área geográfica La Universidad Nacional de Colombia presentó una solicitud de contrato deacceso a recursos genéticos y sus productos derivados, de acuerdo con lodispuesto en el artículo 6% de la Ley 1955 de 2019. En dicha solicitud sereportó la recolección de especímenes pertenecientes a dos especies decoleópteros. Para Asymmathetes vulcanorum se indicó la recolección de Página 3 de 21E-M-TMA-4ñR'VWA 21-N2-2N2410 derivados, pr 54 “Por medio de la cual se acepta una solicitud de contratoesentada por la Universidad Nacional de Colombia en el marco de lo establecido en el articulo Ambiente 6 de la ley 1955 de 2019”

2 8 JUL 2025 de acceso a los recursos genéticos y sus productos 1.638 especímenes; mientras que, en el caso de Premnotrypes vorax, no fueposible determinar el número de individuos recolectados, por las razonesexpuestas en el numeral 1.6 de este documento. A partimicroorganismos, las cuales fuerony sus productos derivados (Tabla 2).ir de estas dos especies de coleópteros se aislaron 1.365 cepas deobjeto de acceso a los recursos genéticos Tabla 2. Coordenadas de puntos de recolección reportadas. Geográficas Magna NacionalID Nombre Latitud Longitud Norte Este Asymmathetes1 | vulcanorum 4° 26'3"N 74° 14' 8" W_ | 2048086,112 | 4862966,6672 | Premnotrypes vorax_|4° 26' 3" N 74° 14' 8" W_| 2048086,112 | 4862966,6673 | Premnotrypes vorax |4° 47! 14,3" N__|74° 4! 3,4" W_| 2087083,264 | 4881653,8714 | Bacillus ssp. 4° 26' 3" N 742 14' 8" W_ | 2048086,112 | 4862966,6675 | Bacillus ssp. 4° 47'14,3"N__|74° 4' 3,4" W | 2087083,264 | 4881653,871 2.5 2.6 Una vez realizado el proceso de verificación de coordenadas se determinaque las muestras de coleópteros arriba mencionadas fueron recolectadas enel departamento de Cundinamambientales de la Corporación Autónomaarca (Anexo 1), en las jurisdiccionesRegional de Cundinamarca (CAR).

Análisis de especies vedadas, amenazadas y listadas en CITES El recurso biológico objeto de acceso a recursos genéticos y sus productosderivados corresponden a microorganismos, los cuales no se encuentranlistados en alguna categoría de amenaza de la Resolución 0126 de 2024, nopresentan alguna veda o restricción nacional o regional, así como tampocose encuentran listados en los apéndices de la Convención sobre el ComercioInternacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres (CITES). Tipo de Muestras Cepas bacterianas aisladas a partir de coleópteros recolectados en cultivos de papa. 2.7 Lugar de procesamiento Tabla 3. Coordenadas de procesamiento de las muestras. e = Este Norte Nombre de Lugar Instituto debiotecnologia -Cundinamarca | Bogota | -74.08526235 | 4.63372944 UniversidadNacional deColombia Pagina 4 de 21F-M-INA-46:V4 21-08-20241054 “Por medio de la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticos y sus productosderivados, presentada por la Universidad Nacional de Colombia en el marco de lo establecido en el artículo6 de la ley 1955 de 2019” Ambiente sss 2.8 Tipo de actividad y uso que se le dio al recurso

Estudio de la actividad biológica de proteínas Cry producidas por especiesnativas de Bacillus thuringiensis sobre insectos plaga que afectan cultivosde importancia económica. 2.9 Metodología 2.9.1 Recolección de muestras de insectos Se muestrearon al azar diferentes cultivos de papa colombiana (Solanumtuberosum spp. andigena var. Diacol Capiro R-12) (región andina). Selocalizaron en el parque ecológico Cerro La Conejera (Coordenadasgeográficas 4°47'14,3"-5°35'13" N, 74°4'3,4"-73°15'49,7" O) y en elasentamiento rural municipal Romeral del municipio de Sibaté (Coordenadasgeográficas 4%26'3" N, 14'8" O). En ninguna de las áreas muestreadas sehabía utilizado ningún producto comercial a base de B. thuringiensis. Serecogieron 200 gramos de muestras (suelo y productos almacenados) conuna espátula estéril a 10 cm de profundidad. Se obtuvieron insectos P. voraxmuertos del suelo y de los tubérculos. Las muestras se almacenaron enbolsas de plástico estériles etiquetadas a temperatura ambiente hasta suprocesamiento. 2.9.2 Cepas bacterianas B. thuringiensis subsp kurstaki (HD1), B. thuringiensis subsp aizawai(HDi37), B. thuringiensis subsp. tenebrionis y B. thuringiensis subsp. sandiego, fueron suministradas por Bacillus Genetic Stock Center (The OhioState University, Columbus, OH). Para aislar las cepas nativas se utilizó elmétodo de selección por acetato desarrollado por Travers et al. (1987).

2.9.3 Análisis del efecto de B. thuringiensis sobre la supervivencia deP. voraxMicroscopía de contraste de fases y SDS-PAGE Las inclusiones parasporales de cada aislado se clasificaron mediantemicroscopía de contraste de fases en uno de los siguientes tipos:bipirámidales, rectangulares, cuboidales, esféricas, triangulares y amorfas.Las suspensiones de cristales de esporas se utilizaron para el análisis deproteínas en geles de SDS poliacrilamida al 10%. 2.9.4 Análisis del gen cry por PCR Las cepas nativas de B. thuringiensis se caracterizaron en función de lapresencia del gen Cry. Las cepas que reaccionaron con los cebadoresgenerales del gen Cry se caracterizaron posteriormente mediante PCRadicionales con cebadores específicos, a fin de identificar la presencia de losgenes Cry 1Aa, Cry 1Ab, Cry 1Ac, Cry 1Ba, Cry 1Da, Cry 2, Cry 3 y Cry 7.Los cebadores del gen cry utilizados fueron diseñados por Cerón et al. Loscebadores Cry utilizados fueron diseñados por Cerón et al. (1994, 1995) yBen-Dov et al. (1997). La preparación del ADN y las PCR se realizaron en un termociclador (Perkins-Elmer modelo 480) siguiendo los métodos de Cerón et al. (1995). 2.9.5 Mutagénesis y aislamiento de proteínas Se han descrito tres mutantes Cry 3Aa en otros lugares (Wu et al. 2000, Wu& Dean 1996) y se construyeron mediante la introducción de las mutaciones

Página 5 de 21F-M-INA-44:V/4 21-02-2N74— 1054 “Por medio de la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticos y sus productosderivados, presentada por la Universidad Nacional de Colombia en el marco de lo establecido en el artículo6 de la ley 1955 de 2019” Ambiente D354E (bucle 1 en el dominio 11), R345A, AY350, AY351 (bucle 1 en eldominio II), Q482A, S484A y R485A (bucle 3 en el dominio II) en el plásmidode expresión pMH10 derivado de pKK233-2 (Farmacia LKB Biotechnology),utilizando el Kit GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen). Tras la mutagénesis, se llevó a cabo la secuenciación del ADNmonocatenario (Macrogen, Corea).Los genes Cry 3Aa de tipo silvestre y los mutantes se expresaron enEscherichia coli XL-1-Blue. Las células se cultivaron durante 48 horas en 500ml de medio TB (Sambrook et al. 1989) que contenía 100 yg/ ml deampicilina. Se prepararon extractos cristalinos y se solubilizaron en tampóncarbonato sódico 50 mM (pH 10,0). La concentración de protoxina solubilizada se determinó mediante el ensayode Lowry (Lowry et al. 1951). Cuando fue necesario, se realizó la activaciónde la protoxina añadiendo tripsina en una proporción de 1:10(tripsina:protoxina, p/v) y se incubó durante 2 horas a 37 “C. La toxinaactivada se utilizó inmediatamente. La protoxina y las toxinas se analizaronmediante electroforesis en gel de SDS poliacrilamida (8%) (SDS-PAGE). 2.9.6 Bioensayos

2.9.6 Bioensayos Se evaluó la actividad biopesticida de diferentes cepas de B. thuringiensis,Cry 3Aa y mutantes, sobre larvas de primer estadio de P. vorax de unacolonia de laboratorio. Los cubos de patata se contaminaron superficialmente con unaconcentración de toxina de 10000 (cepas bacterianas) y 2000 (Cry 3Aa detipo salvaje y mutantes) ng/cm2 diluida en 60 pl de agua desionizada. Loscubos se distribuyeron en los pocillos de las placas y cada uno se infestó conuna larva de primer estadio de P. vorax. Las placas se sellaron y se incubaron en una sala a 18%C, 60 + 5% dehumedad relativa y fotoperiodo de 12:12 h luz: oscuridad. En el bioensayocon insectos se utilizaron 72 larvas neonatas por tratamiento y se registróla mortalidad a los 7 dias (Martínez & Cerón 2002).2.9.7 Evaluación de proteínas Cry recombinantes contra larvas de A.vulcanorum

El plásmido pMH19 (vector de expresión de Cry1Ba) fue donado por el Dr.R.A. de Maagd (Plant Research International, Países Bajos) y se ha descritoanteriormente (Bosch et al., 1994; De Maagd et al., 1999).El gen cry3A se insertó en el vector pQE30-Xa (Qiagen) y también se hadescrito su uso (López Pazos et al., 2009). Las protoxinas Cry se produjeronen Escherichia coli XL-1 Blue. El aislamiento, la solubilización, el tratamientocon tripsina y la purificación de las protoxinas se realizaron siguiendo unprocedimiento descrito (Herrero et al., 2004). Cuando fue necesario, seprepararon toxinas activadas mediante activación proteolítica de lasprotoxinas con tripsina; el tiempo y la proporción tripsina: protoxina para laactivación se determinaron a 37°C.La cepa que expresa Cry1I de Bt var. mexicanensis fue amablemente donadapor el Dr. A. Bravo (Universidad Nacional Autónoma de México); lapreparación, solubilización y activación de la protoxina Cry1l se realizaroncomo se describió anteriormente (Estela et al., 2004). Las concentracionesde proteínas se estimaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamidacon dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) (Sambrook et al., 2001) y elmétodo de Lowry (Lowry et al., 1951) utilizando una curva estándar de Página 6 de 21F-M-INA-46:V4 21-08-202428 JUL 2025 —— 1054

“Por medio de la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticos y sus productosderivados, presentada por la Universidad Nacional de Colombia en el marco de lo establecido en el artículo6 de la ley 1955 de 2019” Ambiente albúmina sérica bovina. Se obtuvieron varios estadios de A. vulcanorum dediferentes cultivos de papa colombianos y se muestrearon al azar. Selocalizaron en el asentamiento rural municipal Romeral del municipio deSibaté (Coordenadas geográficas 4 26030 O N, 74 14080 0 O). En ningunade las áreas muestreadas se había utilizado ningún producto plaguicidacomercial. Los insectos se desinfectaron individualmente en hipoclorito sódico al 0,5%y se colocaron individualmente en viales de plástico que contenían cubos depatata a 18°C y 70% de humedad relativa. Los adultos se mantuvieronalimentándose de hojas de Hedera helix. Se diseñó una dieta artificial pararealizar bioensayos con Cry1B, Cry3A y Cry1I. La composición de la dietaartificial era agar 1,2%, germen de trigo 2,5%, caseína 0,24%, patata 5%,judía 8%, levadura activa 1,2%, éster metílico-p-hidroxi benzoato 0,14%,ácido ascórbico 0,24%, ácido sórbico 0,08%, tetraciclina 0,004%, vitaminasdel complejo B 0,08%, aceite de maíz 0,6%, formaldehído 0,2%.

La mortalidad de las larvas de primer estadio fue inferior al 4% tras 10 díasde cría y la dieta artificial agotada para la cría se sustituyó por una nuevacada 15 días. Para los bioensayos, se utilizaron larvas de primer estadio yse evaluaron tres dosis de protoxinas Cry1B y Cry3A, tres dosis de proteínasCry1B y Cry3A previamente tratadas con tripsina (2000, 4000 y 8000ng/cm2). La dosis utilizada para la protoxina Cry11 y la toxina Cryil fue de8000 ng/cm2. Como control se utilizó un tampón de carbonato sódico.Después de 5 días se leyeron los bioensayos y se calculó el porcentaje demortalidad, utilizando 120 larvas por dosis y repitiendo el ensayo dos vecesa diferentes tiempos. 2.9.8 Identificar del gen aminopeptidasa N (APN) Se recogieron larvas de cuarto estadio y se desinfectaron con una soluciónde hipoclorito sódico de 0,5 ppm. Se disecaron 15 larvas y se tomó elintestino medio para la extracción del ARNm. Se lavaron 30 mg de tejido delintestino medio con agua DEPC y se centrifugaron durante 30 s y se eliminóel sobrenadante, y después se añadió 1 ml de Tri reagentTM (Sigma) pararomper estas células del intestino medio y se resuspendieron en 50 Il deagua DEPC con 1 unidad de RNAse OutTM (Invitrogen). La purificación delARNm se realizó de acuerdo con el proveedor del kit dynabeads (Invitrogen).

El ADNc monocatenario se obtuvo utilizando oligo-dT, MMLV RT y oligo-dGincluidos en el kit SMARTTM (Clontech). La alineación de proteínas APN detres especies diferentes de lepidópteros (Bombixmori, Manduca sexta yHeliothis virescens, con los números de acceso a la base de datos deproteínas del NCBI AAC33301.1, CAA61452.1 y AAC46929.1,respectivamente) y de una aminopeptidasa de coleópteros depositada (T.molitor membrane alanyl aminopeptidase, número de acceso a la base dedatos de proteínas del NCBI AAP94045.1) se realizó utilizando el softwareClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html). Acontinuación, se diseñaron cebadores degenerados basados en lassecuencias de aminoácidos conservadas: f1, f2, f3, f11, r10, r7 y r12 (Tabla1). El cribado por PCR de las parejas de cebadores se realizó con la ADNpolimerasa TITANIUMTM Taq (Clontech) a una temperatura de recocido de45 C. La temperatura inicial de desnaturalización fue de 95°C durante 3 minel paso inicial y 30 s los demás ciclos. Los pasos de extensión se realizarona 68°C durante 1 min 10 s. Extensión final de 10 min. Los productos de laPCR se insertaron en el vector TOPO PCR2.1 y se clonaron células E. coliTOP10 químicamente competentes (Invitrogen). La secuenciación de losinsertos se realizó en un secuenciador ABI automatizado (Macrogen USA)

Página 7 de 21F-M-TNA-44:V/4 21-N8-2N2428 JUL 225 — Ambiente “Por medio de la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticos y sus productosderivados, presentada por la Universidad Nacional de Colombia en el marco de lo establecido en el artículo6 de la ley 1955 de 2019”

para la confirmación de la plantilla. Se utilizó el sistema 5'RACE para laamplificación rápida de extremos de ADNc (Invitrogen). Se utilizaron 200 ngde ARNm del intestino medio de larvas de A. vulcanorum como molde parala transcripción inversa; el ADNc monocatenario se purificó con columnasSNAP (Clontech). La amplificación del extremo 50 se realizó con el cebadorR1Y (Tabla 1). A continuación, el producto de la PCR se volvió a amplificarcon los cebadores R1Y y R2Y (Tabla 1). Para el 30 RACE se utilizó un oligo-dT como cebador y se emparejó con el cebador F1Y (Tabla 1) para la síntesisdel ADNc. A continuación, se realizó la PCR utilizando el cebador F2Y (Tabla1). Los productos de la PCR se clonaron en E. coli TOP 10 utilizando el vectorTOPO PCR2.1 (Invitrogen). A continuación, los plásmidos fueronsecuenciados por la empresa Macrogen (Corea). La secuencia completa delARNm del APN se ensambló manualmente y se depositó en el Genbank(número de acceso GU319110). Basándose en las secuencias proteicasdeducidas de la APN, se predijo un péptido señal en el N-terminal y una señalde anclaje GPI en el C terminal utilizando SignalP 3.0 (Bendtsen et al., 2004)y big-PI Predictor (Eisenhaber et al., 1999). Del mismo modo, los sitios deN-glicosilación de la APN de A. vulcanorum se predijeron mediante elservidor NetNGlyc 1.0 (Gupta et al., 2004). Además, también se predijeronsitios de O-glicosilación en las regiones cercanas al C-termini de la APNutilizando el servidor NetOGlyc 3.1 (Julenius et al., 2005). 2.10 Resultados obtenidos

Se realizó el aislamiento de cepas de Bacillus thuringiensis a partir demuestras de suelo, tubérculos e insectos muertos en cultivos afectados porPremnotrypes vorax. Se identificaron 300 cepas por medio de cultivo enplaca y microscopía óptica, y se amplificaron genes Cry a través de la técnicade PCR. Los genes identificados con oligonucleótidos generales y específicosfueron: Cry1 (Cry1A/Cry1B/Cry1C - 107 cepas), Cry2 (134 cepas), Cry3 yCry7 (51 cepas). El detalle metodológico se encuentra publicado en elartículo científico denominado “Presence and significance of Bacillusthuringiensis Cry proteins associated with the Andean weevil Premnotrypesvorax (Coleóptera: Curculionidae)” (López et al., 2009 A).Para el insecto plaga Asymmathetes vulcanorum (tiroteador de la papa) delcultivo de papa se realizó un bioensayo con larvas de primer instarrecolectadas en cultivos de papa ubicados en El Romeral, Sibaté -Cundinamarca (4° 26' 3” N - 74° 14” 8” W). Las larvas recolectadas fueronexpuestas en placas de cultivo celular, en las cuales se adecuó en cada pozouna dieta artificial específica, la cual fue impregnada con toxinas (proteínaspreviamente tratadas con tripsina) y protoxinas (proteínas sin tratar)clasificadas como Cry1B Cry3A Cry1IA. La mortalidad más alta obtenida fue40% (dosis: 8000ng/cm2) con la toxina Cry1B. El detalle metodológico seencuentra publicado en el artículo científico denominado: “Determination ofCry toxin activity and identification of an aminopeptidase N receptor-likegene in Asymmathetes vulcanorum (Coleóptera: Curculionidae)” (Cortázaret al, 2012).

En 2002, se realizó un estudio previo con Premnotrypes vorax con proteínasCry3Aa, Cry3Ba, Cry3Bb, Cry3Ca y Cry7Aa, en tres diferentes condiciones:solubilizadas a pH 4.0, pH 10 (500ug/ml), activadas con tripsina (500ug/ml),y complejo espora-cristal (10ug/cm2). Este bioensayo no presentómortalidad para las toxinas Cry3Ba, Cry3Bb y Cry7A, y presentó mortalidadbaja (10%) con proteínas Cry3Aa y Cry3Ca presentes en complejo espora-cristal. Tampoco presentó mortalidad con toxinas solubilizadas o activadascon tripsina. El detalle metodológico se encuentra publicado en el artículocientífico titulado: Evaluación de la toxicidad de proteínas de Bacillus Página 8 de 21F-M-INA-46:V4 21-08-20241054 “Por medio de la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticos y sus productosderivados, presentada por la Universidad Nacional de Colombia en el marco de lo establecido en el artículo6 de la ley 1955 de 2019”

28 JUL 2025 —— Ambiente thuringiensis Berliner hacia el gusano blanco de la papa Premnotrypes VoraxHustache (Martínez y Cerón, 2002). Posteriormente, en 2009 se realizó un nuevo estudio con Premnotrypesvorax por medio de un bioensayo realizado con larvas de primer instarrecolectadas de cultivos de papa en cosecha del cerro La Conejera (4° 47’14,3” N - 74° 14” 3,4” W) y de El Romeral, Sibaté - Cundinamarca (4° 26’3” N - 74° 14” 8” W). Las larvas recolectadas fueron alimentadas con cubosde papa impregnados con toxinas insecticidas a partir de cepas nativas,cepas patrón que expresan únicamente Cry3A y cepas que expresan Cry3Amodificadas genéticamente. Los resultados evidenciaron una mortalidadbaja (10-20%) con proteínas Cry de cepas nativas y Cry3A; para lasproteínas Cry3a modificadas la mortalidad fue de entre 6 y 15%. El detallemetodológico se encuentra publicado en el artículo científico denominado“Presence and significance of Bacillus thuringiensis Cry proteins associatedwith the Andean weevil Premnotrypes vorax (Coleoptera: Curculionidae)”(López et al., 2009 A).

Respecto a los insectos Tecia solanivora (insecto lepidóptero) eHypothenemus hampei (insecto coleóptero), se realizaron ensayos deActividad tóxica (CL50) con una proteína híbrida SN1917 modificadagenéticamente (Modificación del dominio II de Cryil, reemplazado pordominio II de CryiBa) con el objetivo de determinar aumento en las tasasde mortalidad. Las larvas de T. solanivora fueron expuestas a cubos de papaimpregnados con la toxina e H. hampei fue expuesta a dieta artificial con lamisma toxina. Los resultados respecto a H. hampei demostraron resistenciadel insecto por la proteína (0% de mortalidad), y T. solanivora 52% demortalidad frente a protoxina (20ng/cm2) y 60% frente a toxina activa(392ng/cm2). El detalle metodológico se encuentra publicado en el artículocientífico denominado: “Activity of Bacillus thuringiensis hybrid proteinagainst a lepidopteran and a coleopteran pest” (López et al., 2009 B).

Para el insecto plaga Hypothenemus hampei, plaga de cultivos de café, serealizó un Bioensayo para determinar la actividad tóxica de proteínas Cry1B(500 - 5000 ng/cm2) y Cry3A (1000-10000 ng/cm2) sobre dieta artificial,a partir de protoxinas y toxinas activas con tripsina. Con Cry1B activa sedeterminó mortalidad entre 23.7 y 40%, con Cry1B protoxina la mortalidadse determinó entre 24.5 y 43%. Así mismo, para la toxina activa Cry3A lamortalidad fue entre 20 y 29%, y para la protoxina entre 22 y 30%. Lo cualevidencia que Cry1B presenta mayor efectividad sobre el insecto de estudio.El detalle metodológico se encuentra publicado en el artículo científicodenominado: “CryiB and Cry3A are active against Hypothenemus hampeiFerrari (Coleoptera: Scolytidae)” (López et al., 2009 C).El mecanismo de acción de toxinas Cry3D (Figura 2.) inicia cuando la larvablanca ingiere esporas y cristales de los microorganismos; luego se da unaetapa en donde el cristal por acción del pH del intestino medio de la larva(Bravo et al. 2011), solubiliza las protoxinas, las cuales son posteriormenteprocesadas por proteasas del intestino medio, liberándose el fragmentotóxico. Una vez finaliza la activación, la toxina se une con alta afinidad aproteínas receptoras localizadas en las vesículas de membrana de lasmicrovellosidades apicales (VMMAs) del intestino medio de la larva. Durantela unión toxina-receptor, las toxinas sufren una oligomerización, en dondesubunidades de éstas se insertan en la membrana formando un poro lítico(Piggot y Ellar, 2007).

Con base en lo anterior, la investigación dirigida hacia Asymmathetesvulcanorum, insecto plaga de la papa, tenía como objetivo determinar lapresencia de receptores de oxinas Cry en el intestino medio del insecto, a Página 9 de 21F-M-TMA-4fWA 21-N2-2N2428 JUL 2025 —F 1054 “Por medio de la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticos y sus productosderivados, presentada por la Universidad Nacional de Colombia en el marco de lo establecido en el artículo6 de la ley 1955 de 2019” Ambiente través del uso de métodos moleculares como 5'RACE. Como resultado, apartir de la extracción de RNA de larvas de primer instar recolectadas, seobtuvo cDNA que permitió la amplificación e identificación de un receptorintestinal denominado Aminop