MINAMBIENTE - Resolución 934 de 2024

COLOMBIAPOTENCIA DE LA

© VIDA MINISTERIO DE AMBIENTE Y DESARROLLO SOSTENIBLE “Por la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticos ysus productos derivados, presentada por la Universidad Francisco de PaulaSantander bajo lo dispuesto en el articulo 6° de la Ley 1955 de 2019” LA DIRECTORA DE BOSQUES, BIODIVERSIDAD Y SERVICIOSECOSISTEMICOS En ejercicio de sus facultades legales y especialmente las conferidas en el numeral14, del artículo 16 del Decreto Ley 3570 de 2011 y la Resolución 1756 de 2022, y CONSIDERANDO ANTECEDENTES Que mediante comunicación con radicado” No. 11446 del 9 de abril de 2021, elVicerrector de Investigación y Extensión de la Universidad Francisco de PaulaSantander presentó a la Dirección de Bosques, Biodiversidad y Servicios Ecosistémicosde este Ministerio la solicitud de Contrato de Acceso a los Recursos Genéticos y susProductos Derivados con el fin de autorizar las actividades de acceso a los recursosgenéticos y sus productos derivados realizadas en desarrollo del proyecto deinvestigación denominado: “Potencial biofertilizante, biocontrolador y antagonista deaislados nativos de suelos agrícolas en Norte de Santander” bajo el amparo de loestipulado en el artículo 6° de la Ley 1955 de 2019, Que mediante comunicación con radicado No. 2103-2-1579 del 7 de julio de 2021, laDirección de Bosques, Biodiversidad y Servicios Ecosistémicos del Ministerio deAmbiente y Desarrollo Sostenible requirió a la Universidad Francisco de PaulaSantander aportar información adicional a la solicitud de contrato para el proyectotitulado: "Potencial biofertilizante, biocontrolador y antagonista de aislados nativos desuelos agrícolas en Norte de Santander”.

Que mediante comunicación con radicado No. E1-2021-35246 del 7 de octubre de2021, la Universidad Francisco de Paula Santander remitió al Ministerio de Ambientey Desarrollo Sostenible las respuestas a los requerimientos realizados medianteradicado No. 2103-2-1579 del 7 de julio de 2021... Que la Dirección de Bosques, Biodiversidad y Servicios Ecosistémicos del Ministerio deAmbiente y Desarrollo Sostenible mediante Auto No. 278 del 9 de noviembre de 2021admitió la solicitud de Contrato de Acceso a los Recursos Genéticos y sus ProductosDerivados bajo lo establecido en el Artículo 6° de la Ley 1955 de 2019, presentada porla Universidad Francisco de Paula Santander para autorizar las actividades de accesoa los recursos genéticos y sus productos derivados realizadas en desarrollo de O F-M-INA-46: V2 - 25/05/2023 yPágina 1 | 28COLOMBIA a VIDA U“Por la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticosy sus productos derivados, presentada por la Universidad Francisco de Paulasantander bajo el amparo de la OCENCONG lidad stable e artículo 6° de la proyecto de investigación denominado: a biofertilizante, biocontrolador yantagonista de aisiados nativos de suelos ae en Nore de Santander”. a Que de igual forma, el acto administrativo referido ordenó a la Universidad Francisde Paula Santander realizar una. publicación. del extracto de la solicitud en un medicde comunicacién dentro de los cinco O días hábiles siguientes a la notificac on deAuto. | : | a o

Que de igual forma, el acto administrativo referido ordenó a la Universidad Francisde Paula Santander realizar una. publicación. del extracto de la solicitud en un medicde comunicacién dentro de los cinco O días hábiles siguientes a la notificac on deAuto. | : | a o Que mediante radicado No. 40720 del 18 de no lembre. . miversidad|Francisco de Paula Santander remitió la publicación del Auto No. 278 del 9 denoviembre de 2021, del proyecto denominado: “Potencial bjofertilizante,biocontrolador y a |de asados nativos de pues So en| Nove de :Santander”. : : : E Que mediante comunicación con radicado No. 2103-E2-2022-02132 del 25 de abril de |2022, la Dirección de Bosques, Biodiversidad iServicios Ecosistémicos del Ministe lode Ambiente y Desarrolio Sostenible requir | ESantander aclarar el área de recoleccibiofertilizante, biocontrolador y antagonista de aislados nativos de suelos agrNorte de Santander”. Que mediante comunicación con radicado No. 202251022622 el OLde julio.de 2022, a No. do bb 3082 odias del 25 de abril de eeQue:eecomunicacion con radicado!No.2103202de e yy Desarrollo sostenible reqSantander ampliar información de las actividac E“Potencial biofertilizante, biocontrolador y antagonistagricolas en Norte de Santander’.

lá Universidad Francisco de Paula Santander renDesarrollo Sostenible las respuestas a los requerimiento eaNo, 2103-E2-2022-02132 del 25 de abril a _ proyectos elencos porda Universidad enede 2019. a de 2022, la Dirección de Bosques, Biodiv__ Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostelde Paula Santander la fecha de la reunión,2022 de manera virtual por la plataforma de:los requerimientos.Que mediante comunicación con radicado No2022 la Universidad Francisco de Paula Sant_ Desarrollo Sostenible una prórroga para I"$ COLOMBIAa efte POTENCIA DELAos VIDA“Por la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticosy sus productos derivados, presentada por la Universidad Francisco de PaulaSantander bajo el amparo de la excepcionalidad establecida en el artículo 6° de laLey 1955 de 2019” Ambiente Que mediante comunicación con radicado No. 21032022E2023348 del 22 de diciembrede 2022, la Dirección de Bosques, Biodiversidad y Servicios Ecosistémicos delMinisterio de Ambientey Desarrollo Sostenible otorgó un plazo para la entrega de lainformación requerida hasta el 28 de febrero de '2023 para entregar la informaciónsolicitada.

Que mediante comunicación con radicado No. 2023E1007903 del 28 de febrero de2023, la Universidad Francisco de Paula Santander solicitó una segunda prórroga pararesponder los requerimientos realizados. Que mediante comunicación con radicado No. 21032023E2006478 del 10 de marzo de2023, la Dirección de Bosques, Biodiversidad y Servicios Ecosistémicos del Ministeriode Ambiente y Desarrollo Sostenible otorgó a la Universidad Francisco de PaulaSantander un segundo plazo para la entrega de la información requerida hasta el 20de abril de 2023 para entregar la información solicitada, y recomienda se adelanterespuesta a los requerimientos que no dependen del Ministerio del interior. Que mediante comunicación con radicado No. 20231017867 del 25 de abril de 2023,la Universidad Francisco de Paula Santander remitió al Ministerio de Ambiente yDesarrollo Sostenible lás respuestas parciales sin el certificado del Ministerio delInterior. Sin embargo, posteriormente, mediante comunicación con radicado No.2023E1041777 del 11 de septiembre de 2023, la Universidad allegó el certificado delMinisterio de Interior. . Que mediante comunicación con radicado No. 2024E1004467 del 31 de enero de 2024,la Universidad Francisco de Paula Santander remitió documentación relacionada conrespecto la nueva representante legal de la Universidad y sus respectivos soportes. Que en cumplimiento de lo previsto en el artículo 29 de la Decisión Andina 391 de1996 de la Comisión del Acuerdo de Cartagena y. las competencias asignadas por elDecreto 3570 de 2011 a la Dirección de Bosques, Biodiversidad y ServiciosEcosistémicos, se emitió Dictamen Técnico Legal No. 354 del 17 de junio de 2024,mediante el cual se tuvieron en cuenta las siguientes consideraciones:

1. ANÁLISIS DE LOS ASPECTOS TÉCNICOS DE LA SOLICITUD DE ACCESO 1.1. Justificación Las bacterias diazótrofas pueden estimular el crecimiento de los cultivos mediantediversos procesos como la síntesis de hormonas, fijación de nitrógeno y producción deSideróforos entre otros. El conocimiento de bacterias diazotróficas predominantes enlos agroecosistemas permitiría establecer su uso eficiente como potencialesbiofertilizante, biocontrolador y antagonista.

La fijación biológica de ñitrógeno, constituye el mayor aporte biológico de nitrógeno ala biosfera, es vista como una fuente esencial y potencial para el desarrollo de agrosistemas sustentables (Pedraza R.O, et al., 2010) ,es por esto que la evaluación delpotencial como promotores de crecimiento vegetal de los microorganismos quehabitan el suelo se convierte en una alternativa viable que permite la recopilación deinformación y la futura formulación de biofertilizantes que ayuden a disminuir la F-M-INA-46: V2 - 25/05/2023Página 3 | 28COLOMBIA. ¢© POTENCIA DELA aVIDA“Por la Cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a os recursos genéticosy sus productos derivados, presentada por la Universic ad FFrancisco de PaulaSantander bajo el amparo de la excepcionalidad establecida en el artículo 6° de laLey 1955 de 2019" : Ambiente fertilización química y restaurar en alguna medida las caracteristicas naturales de los_ suelos dedicados a la nto: o a

Ambiente fertilización química y restaurar en alguna medida las caracteristicas naturales de los_ suelos dedicados a la nto: o a Es importante. conocer. el numero. y las especiesde.bacterias diazotrcnCaspredominantes en los agroecosistemas especialmente en los sistemes de prod ccióncaracterizados por la aplicación de agroquímicos sintéticos Y definir su eficiencia comoBiofertilizante potenciales para aumentar las alternativas en el desarrollo de unaagricultura sustentable y con producción a bajo costo. (Alfonso et al., 2005) El interésde este proyecto será conocer las principales bacterias diazótrofas rizosféricas yendófitas en cultivos de interés en la mayor zona de producción. del departamentoNorte de Santander. á 1.2. Alcance del proyecto _Bioprospeccion sin fines comerciales. | 1.3, Objetivo generalEvaluar el potencial Biofertilizante de aislados nnativos. de suelos agrícolas en Norte deSantander. : a a .1.4. Objetivos específicos1.4.1, Aislat microorganismos con potencial Date a partir. desuelosagrícolas. 1.4.2. Caracterizar fenotípica bioquímica Y molecularmente los microorganismosaislados. : . 1.4.3. Realización de pruebas fisiológicas para la producción de ácido.indolacético AIA, Fosforo y Sideróforos. : 1.4.4. Producción de inoculantes microbianos pe el desarrollo de plantas «en :=. etapa de vivero. a

1.5. Área de aplicación Ciencias Básicas y microbiologíaagrícola. 1.6. Lista de Referencia de Jos Recursos Biológicos objeto del proyecto “ aArtículo 6° de la Ley 1955 de 2019. Tabla 1. Lista de Referencia de Jos Recursos Biológicos informados en la solicitudde Acceso a los Recursos Genéticos. y sus Productos Deriva joe, :Cantidad deaislamientos Tipo de muestra.Microorganismo Aeromonas hydrophila : 1. o Suelo RizosféricoAzospirillum brasilensis 6 “Suelo encAzospirillum sp. a 4 / RizósferaAzotobacter chrococcum | E Rizósfera— F.M-INA-46:V2 - 25/05/2023 —Página 4128COLOMBIAPOTENCIA DELA VIDA |“Por la cual se acepta una solicitud. de contrato de acceso a los recursos genéticosy sus productos derivados, presentada por la Universidad Francisco de PaulaSantander bajo el amparo de la excepcionalidad establecida en el artículo 6° de laLey 1955 de 2019” Ambiente

Ambiente Azotobacter nigricans 3 Material vegetal, LycopersiconesculentumAzotobacter sp. 6 Suelo agricolaAzotobacter vinelandii 3 Suelo agricolaBacillus sp. 2 Suelo agricolaBacillus thuringiensis 3 Suelo agricolaBurkholderia ambifaria _ 1 RizósferaBurkholderia cepacia 8 Suelo agricolaBurkholderia glumae 8 Suelo agricolaBurkholderia sp. 5 Suelo agricolaEnterobacter cloacae 1 ‘| Suelo agrícolaEnterobacter sakazakii 1 Suelo agricolaGluconacetobacter 1 Suelo agricolaazotocaptansGluconacetobacter 1 RizósferajohannaeGluconacetobacter sp. A RizósferaHerbaspirillum sp. 2 RizésferaKlebsiella neumonia 4 Suelo RizosféricoKlebsiella oxytoca 2 Suelo RizosféricoPseudomonas 1 Suelo RizosféricofluorescensPseudomonas putida 3 Suelo agricolaPseudomonas sp. 5 Suelo agricolaSerratia fonticula . 2 Suelo RizosféricoStenotrophornonas 1 Suelo agricolamaltophilia : Así mismo el Recurso Biológico listado en la Tabla 2 corresponde también para lasactividades pendientes de recolección en el cual la Universidad pretende realizarnuevos aislamientos de bacterias a partir de muestras de suelos agrícolas, materialfoliar, raíces y tallos de diferentes cultivos de la región en Norte de Santander.

1.7. Responsable técnico Laura Yolima Moreno Rozo. 1.8. Proveedor del recurso biológico « Ministerio de Ambiente y Desarrollo - Sostenible en el caso de losmicroorganismos. ' . : Productores agrícolas de Norte de Santander para las muestras de origenagrícola. o F-M-INA-46: V2 - 25/05/2023Página 5 | 28“Por la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticosy sus productos derivados, presentada por la Universidad Francisco de PaulaSantander bajo el amparo de la excepcionalidad establecida en el artículo 6° de laLey 1955 de 2019” 1:9. Área geográfica La. Universidad. Francisco de Paula Santander presentó una solicitud bajo lasdisposiciones del artículo 6° de la Ley 1955 de 2019,donde se informa que laprocedencia del recurso biológico de 83 cepas de bacterias pertenecientes a / generosy 19 especies las cuales fueron aisladas a partir de muestras de suelos agrícolas,material foliar, raíces y tallos de diferentes cultivos localizados en el departamento deNorte de Santander: así mismo, se pretende seguir |aisiando muestras de bacterias |asociadas a suelos agricolas, material foliar, raíces. y tallos de diferentes cultivoslocalizados en el departamento de Norte de Santander.

1.9.1. Actividades de recolección informadas por la Universidad Franciscode Paula Santander en consideración al artículo 6° de laLey 1955 de2019. : : Asi mismo, en la solicitud de Contrato de Acceso a los Recursos Genéticos y susProductos Derivados bajo las disposiciones del Artículo 6°de la Ley1955 de 2019,presentada por la Universidad Francisco de Paula Santander se informa laprocedencia de recolección de material biológico correspondientes a 83 cepas debacterias pertenecientes a / géneros y 19 especies de bacterias procedentes enmuestras de suelos agrícolas, material foliar, raices y tallos de diferentes cultivosdel departamento de Norte de Santander, adicionalmente se reporta que iniciaronactividades de recolección desde el año 2011 (Tabla Eo Tabla 2. Puntos de recolección de procedencia del yrecurso biológico muestras desuelos agrícolas, material foliar, raices y tallos de di rentes cultivos deldepartamento de Norte de Santander. . Sistema de Referencia.taxon Municipio |. wes 84 (código - EPSG 4326)Gén [| im Aeromonas hydrophila Chinácota E 7,549357338843 -72,585554122921Azospirillum brasilensis Chindcote | 7523002934424 | -72,567805738202 Azospirillum sp. Zulia do 8,130948900752 :72,612762451172 ‘Azotobacter chrocóccum Chinécota ; 7523402034404 : | asereos rane aAzotobacter nigricans. : Chinácota : 7,523402034434 ke “7256700573820 LLAzotobacter.sp: : Chinácota : 7,523402934424. ..572,56/809/38202

Azotobacter vinelandii. Chinácota : 7523402934424 +72;567805738202 Bacillus sp. Chimácota ss | 7/538800735779 | aesesaiseragoa Bacillus thuringiensis Los patios E 7,834642823730 : 972,4B0076354094 Ste Burkholderia -ambifatia Chiriacota £057,523402934424: =72)567805738202 Burkholderia cepacia Chindcots’ | | 7sabnsraseess| pz sesssaizign, | Burkholderia glumae : Chinatota 5 7,523402934424 | | 17 £50/805/38202 Burkhelderia spis Chindcota . 7,523402934424: . -72,567605738202 a Enterobacter cloacae E Chiriátota 7549357338843 272,585554122921. Enterobactér sakazakii 0 Chindcota | 7549357338643 | 72 s8s55ai22021 _ Gliconacetobacter azotócaptans: Chinácota 7823402934424 || -72,567805738202 Glutonacetobatter jonannae o Chinácota 7,523402934424 -72,567805738202 EMINA”AB: V2> 35/0 20pagina 6 | 28"4 COLOMBIA¿Ea POTENCIADELA : VIDA“Por la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticosy sus productos derivados, presentada por la Universidad Francisco de PaulaSantander bajo el amparo de la excepcionalidad establecida en el artículo 6 de laLey 1955 de 2019”

Agniblente Gluconacetobacter sp. Zulia 8,130948900752 -72,612762451172 Herbaspirillum sp. Zuña 8,130948900752 -72,612762451172 Klebsiella neumonía . Chinácota 7,549357338843 -72,585554122921 Klebsiella oxytoca Chinácota 7,549357338843 -72,585554122921 Pseudomonas fluorescens Chinácota + 7,549357338843 . 772,585554122924 Pseudomonas putida Chinácota 7,549357338843 -72,585554122921 Pseudomonas sp. Chinácota 7,549357338843 fF .72,585554422921 Serratia fonticula. Chinácota 7,549357338843 -72,585554122921 Stenotrophomonas maltophilia Chinácota 7,549357338843 -72,585554122921 punto de recolección reportado como Villa del Rosario los patios al realizar laverificación de coordenadas se evidencia que la coordenada corresponde a LosPatios. . De las 83 cepas de bacterias aisladas a partir de muestras de suelos agrícolas,material foliar, raíces y tallos, en los 23 registros reportados por la UniversidadFrancisco de Paula Santander una vez realizado el proceso de verificación decoordenadas se encuentra que las muestras provienen de los municipios de LosPatios, Del Zulia y Chinácota, en la Jurisdicción ambiental de la CorporaciónAutónoma Regional de la Frontera Norcriental CORPONOR (Anexo 1, 2 y 3).

1.9.2. Actividades de recolección pendientes por realizar. Teniendo en cuenta que la Universidad manifiesta que, a partir de muestras desuelos agrícolas, material foliar, raíces y tallos de diferentes cultivos de la región enNorte de Santander se realizarán aislamientos de los microorganismos objeto delacceso, y entendiendo que la recolección de estos se entiende como el aislamientode estos en el laboratorio, .este Ministerio solo autorizará el aislamiento demicroorganismos procedentes de muestras de suelos agrícolas, material foliar,raíces y tallos de diferentes cultivos de la región en Norte de Santander ubicadosen los municipios de Los Patios, Del Zulia y Chinácota. Para el caso de las muestras de suelos agrícolas, material foliar, raíces y tallos deldepartamento de Norte de Santander, la Universidad deberá remitir copia de loscontratos accesorios que en este caso en particular corresponderán a losdocumentos que permitan evidenciar la donación o compra de las muestras de sueloagrícola. 1.10. Análisis de especies vedadas o amenazadas Los recursos biológicos que serán objeto de acceso a recursos genéticos y susproductos derivados corresponden a microorganismos, los cuales no se encuentranlistados en alguna categoría de amenaza de la Resolución 0126 de 2024, no presentanalguna veda o restricción nacional o regional, así como tampoco se encuentran listadosen los apéndices de la Convención sobre el.Comercio Internacional de EspeciesAmenazadas de Fauna y Flora Silvestres, . 1.11. Tipo de muestra Microorganismos asociados a muestras de suelos agrícolas, material foliar, raíces ytallos de diferentes cultivos de la región en Norte de Santander. F-M-INA-46: V2 - 25/05/2023Página 7 | 28. A E ry

Microorganismos asociados a muestras de suelos agrícolas, material foliar, raíces ytallos de diferentes cultivos de la región en Norte de Santander. F-M-INA-46: V2 - 25/05/2023Página 7 | 28. A E ry “Por. lael se acepta una solicitud. de contrato de acceso a los recursos genéticosy sus productos derivados, presentada por la Universidad Francisco de PaulaSantander bajo el amparo de la excepcionalidad establecida €en el artículo 6? de laLey 1955 de 2019" : AmbienteAS UL A 1.12. Lugar de procesamiento Las «muestras fueron. y. se procesaran en el Laboratorio de Investigaciones enMicrobiología Avanzada, Universidad Francisco de Paula Santander, Coordenadasgeográficas latitud 7°53'53,000016" N. y longitud 72°29'1 SVU . W. 1.13. Tipo de actividad y uso que dará al:recurso Actividades de investigación científica. Bioprospección, de la biodiversidad microbianaasociada a suelos de cultivos para identilicar y obtener nuevas fuentes de inoculantes __: microbianos a escala de laboratorio y aplicacion en campo de microorganismos con _1 potencial biofertilizante y biocontrolador, así mismo, el aislamiento producción de: metabolites microbianos a escala de laboratorio. : 1.14, Metodologia

1.14, Metodologia 1.14.1. Metodología de muestreo en campoSe toman muestras de suelo, material foliar, raíces y tallos de diferentes cultivosde la región, en etapa joven, loscuales son recolectados en sobres de papelhastauso en el laboratorio. En el caso de la muestra de suelo, se toman submuestras dela zona rizosférico, a 10 cm de profundidad. : :La muestra de suelo-es homogenizada en el laboratorio, de los cuales se toman 10gr y se adicionan en una solución diluyente, para realizar diluciones seriadas yposteriormente realizar la siembra en medios solidos selectivos de acuerdo. con elgénero de interés. El material foliar, las raíces y los tallos son“macerádos para led pesar 10 gramosde cada muestra y realizar las diluciones seriadas y posteriormente realizar lasiembra en medios solidos selectivos de acuerdo con el género de interés. : 1.14.2. Cuantificación mediantela técnica del Número Más Probable. :Las bacterias.diazotroficas encontradas en su hábitat principal son aisladasmediante la técnica del NMP a partir de diferentes muestras de suelo. Se realizandiluciones seriadas de suelo hasta 10-7 y se siembran en los mediossemisólidosNFb (Azospirillum sp.), INFb (Herbaspirillum sp.), LGI (Gluconacetobacter sp.) yJMV (Burkholderia sp.). Los inoculados se incuban durante 8 días a 32°C. La lectura--e interpretación de resultados se realiza mediante la tabla de Mc Craddy (Débereineret al., 1995). :

L 14. 3. Aislamiento de microorganismos.El aislamiento de cultivos puros depende de los resultados obtenidos en el recuentode NMP para los cuatro medios selectivos semisólidos y libres de nitrógenoa evaluados NFb (Azotobacter sp., Azospirillum sp.), INFb (Herbaspirillum sp.), LGI| (Gluconacetobactér sp.), y JMV (Burkhlodéria Sp.) KING B (Pseudomonas sp.)Además, es necesario el uso de claves para el aislamiento.Se realiza siembradirecta en cada uno de los medios selectivos sólidos correspondientes esperandoobtener de esta forma colonias aisladas bajo las Mismas condiciones de crecimientoen los diferentes medios selectivos y a partir de las mismas llegar a un cultivo puroempleando el métódo de siembra por francés o estria q al no de la| muestra que permite el crecimiento de colonias aisladas... ee _FeM-INA+46: V2 = 25/05/2023.Pagina 8 | 28COLOMBIA -fq POTENCIA DELAo :a VIDA“Por la cual se acepta una solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticosy sus productos derivados, presentada por la Universidad Francisco de PaulaSantander bajo el amparo de la excepcionalidad establecida en el artículo 6 de laLey 1955 de 2019” Ambiente 1.14.4. Método rápido de identificación bacteriana métodos rápidos. Los aislados obtenidos se siembran por duplicado en placas de agar nutritivomediante el método de estría e incubados a 35 + 2 °C de 24 a 48 h. Después deltiempo de incubación se realiza la lectura de la prueba mediante el uso de una tablade colores que permite dar una puntuación a cada prueba y este un código a cadaaislado. Los resultados se determinan por el viraje del color de los pozos, como loindica la tabla de lectura del kit de identificación.

1.14.5. Caracterización Fisiológica de los aislados. 1.14.5,1. Determinación de AIA. Microorganismos capaces de metabolizar el Ácido Indo! Acético, determinación dela producción de compuestos indólicos. Para cada uno de los aislados se tomancolonias jóvenes y se inoculan en 50 mL de caldo DYGS al 2%, los caldos se llevana incubación durante 3 días a 320 C y 120 rpm. La biomasa obtenida se centrifugaa 8000 rpm durante .10 minutos. Las células se suspenden en 10 mL de bufferfosfato estéril 0,06 M y pH 7,0; ajustar la densidad óptica a 0,5 unidades deabsorbancia que corresponden a un recuento de 10 8.UFC/mL usando una longitudde onda de 605 nm en espectrofotómetro. De esta suspensión celular se toman 100UL y se inocularan por triplicado en 25 mL de caldo DYGS con precursor del ácidoindol acético y fuente de nitrógeno. Sé incuban en oscuridad y agitación de 120rpm. Después de 48 h de incubación, se centrifugan 10 mL del caldo microbiano a8000 rpm durante 10 minutos; Se toman 2 mL del sobrenadante y se adicionaron8 mL de reactivo de Salkowsky hasta que se obtiene una coloración rosada queevidencia la presencia de compuestos Indólicos totales, Se realiza la lectura de laabsorbancia de las muestras a una longitud de onda de 535 nm. La concentraciónde compuestos indólicos se calcula utilizando la ecuación de regresión lineal de lacurva de calibración construida a partir de diferentes concentraciones de ácidoindolacético, AIA con la adición del reactivo de Salkowsky y leídas a 535 nm.

1.14,5.2, Determinación de solubilización de fosfatos. Índice de solubilización de Fósforo a nivel cualitativo y cuantitativo por losmicroorganismos aislados. Para cada uno se toman colonias jóvenes y se inoculanen 50 mL de caldo DYGS al 2% y se llevan a incubación durante 5 días a 320 C y120 rpm. La biomasa obtenida se centrifuga a 8000 rpm durante 10. Elsobrenadante se descarta y las células se suspenden en 25mL de buffer fosfatoestéril 0,06 M y pH 7,0; el procedimiento se repite hasta que la densidad óptica seajusta a 0,5 unidades de absorbancia que corresponden a un recuento de 10 8UFC/mL usando una longitud de.onda de 605 nm. De esta suspensión celular setoman 100uL y se inoculan en caldo con fosfato tricálcico, sin indicador de pH. Loscultivos se incuban a 32°C, con agitación continua a 120 rpm. Se realiza un controlpor triplicado sin inocular y se incuba bajo las mismas condiciones. La lectura de laconcentración de Fósforo disponible se realiza por el método de Bray II, ajustadopara muestras de caldos microbianos. Luego de la etapa de incubación se centrifuga10 mL del cultivo microbiano a 6000 rpm durante 10 minutos. Se toma elsobrenadante y se adiciona 10 mL de la solución extractora y se agita durante 1minuto. Luego, se toma un 1 mL de está solucióny se le adiciona 9 mL de la solucióncoloreadora, se deja reaccionar durante 15 minutos y se lee a una longitud de ondade 880 nm. La concentración de Fósforo disponible (ug/mL de P205) que indica lacapacidad de solubilización de fosfatos, se calcula utilizando la ecuación de ra

F-M-INA-46: V2 - 25/05/2023Página 9 | 28: COLOMBIAG POTENCIA DELA VIDA“Por la cual se acepta una Solicitud de contrato de acceso a los recursos genéticosy sus productos derivados, presentada por la Universidad Francisco de PaulaSantander bajo el apela de la excepcionalidad establecida en el artículo 6° de laLey 1955 de 2019" a . lineal de la curva de calibración construida a partir de diferentes concentraciones de __KH2POz Con la adición delas soluciones o y coloreadora y leídasa. 600 om.

1.14.5.3, Determinación de Sideróforos. .: Producción de Sideróforos por los microorganismos diazótrofos de interés. Para cada |Uno de los aislados se inocula 50 mL de caldo DYGS al 2% y se lleva a incubación_ durante 8 días a 320 C y 120rpm. La biomasa obtenidase centrifuga a8000 rpmdurante 10 minutos. El sobrenadante es descartado y las células son suspendidas oen 25 mL de buffer fosfato estéril 0,06M y pH 7,0; el procedimiento se repite hastaque la densidad óptica nm se ajuste a 0,5 Unidades de absorbancia quecorresponden a un recuento de 108 UFC/ML usando una longitud de onda de 605.Dé esta suspensión celular se toma 2, 5 mL y se inocula por.triplicado en 50mL de ©caldo Minimo Fiss, los cultivos se llevan a incubación a 32°C, con agitación continuaa 150 rom. Se realiza un control por triplicado sin inocular y se incuba bajo lasmismas condiciones. A partir de estos cultivos se toma. 10 mL y se trenshere. a untubo centrifuga para realizar la determinacion de sideróforos. .La centrifugación se realiza a 8000. rpm durante 10 min,se tome.sobrenadante obtenido y se adiciona 2 mL de una solución de 5mM de rato oférrico en 0,14 M de ácido perclórico. Una vez obtenida la reacción, se realiza lalectura de la absorbancia en espectrofotómetro a unaJongitud, de onda de 525 nm.La

concentración de sideróforos se calcula Utilizando la ecuación de regresión lineal .de la curva de calibración construida a partirde difer ntes concentraciones de_unsideréforos tipo hidroxamato (Mesilato de deferroxia nina, SIGMA)con la sol. .de perclorato férrica y leidas en el mismo. espectrofotómetro a 525nmDeterminación de la fijación biológica de nitrógeno. Para cuant a je :Nitrógeno para los aislamientos, se utiliza la metodología de micr -Kjeldhal _propuesta por Kuss et al. (2007). . : :

A partir de una cepa de. cada aislamiento :se realiza un culo bactDYGS, ajustando el inóculo bacteriano a una concentración celular de0,5 de absorbancia que corresponde a un recuento de 108 UFC/mL.suspensión se inocula 1000 ul en viales con 10 mL de medio libre denitrógenosemisólido según el aislamiento. Después del crecimiento bacteriano se almacenan |en congelador a -20°C hasta su análisis. Se continua con la lisis para la liberacióndel contenido celular, colocando los viales en autoclave durante 5mina 15 librasde presión. De la suspensión resultante se adicionan 5a en un tubo para ladigestión de toda la muestra con el fin t; ansformar todo el nitrógeno orgánico a Unaforma mineral. : . : Para la digestión, se adiciona al tubo que contiene la muestra, 4 mL H2SOs .concentrado y 10 mL de H20», y se coloca en el equipo de digestión auna |temperatura inicial de 180 C por 120 mía y luegó a 375% durante 60 min.Transcurrido el tiempo se retiran los. tubos del digestor.y se aforan El 50.mi con |agua destilada en balón aforado; Luego se procede a leer las uestras en elespectrofotómetro Para la cuantificación del Nitrógeno total transformad a NH>+el cual reaccionará con la adición de reactivo de Nessler y se generará n coloramarillo-«naranja en la solución, que se comparará con la curva de calibración delespectrofotómetro. : : .La concentración de Nitrógeno total (Nt) ranstermado a NH3+ (ug/mL de NH3+)que indica la capacidad de solubilización de Nitro no, Se calcula. utilizando laecuación de regresión lineal de la curva de calibración construida a pe yrti